Многим ферментам для работы нужна небелковая часть — кофактор. Кофакторы бывают двух типов: ионы металлов и коферменты (сложные органические молекулы). Белковая часть без кофактора — апофермент (неактивна), вместе с кофактором — холофермент (активный). Прочно связанный кофермент называют простетической группой.

Коферменты объясняют, зачем нужны витамины и микроэлементы: без них не работают целые группы ферментов. Поэтому недостаток витамина проявляется как поломка конкретного обмена, а некоторые коферменты применяют как лекарства и добавки.

НАД⁺ и НАДФ⁺ (из витамина PP/B3, ниацина) — главные переносчики водорода и электронов. Они принимают гидрид-ион от субстрата, превращаясь в НАДН и НАДФН. НАД работает в основном в катаболизме (даёт энергию), НАДФ — в анаболизме (синтез).

Тетрагидрофолат (ТГФК, из фолиевой кислоты B9) переносит одноуглеродные группы (метил, формил и др.), нужные для синтеза ДНК. Кобаламин (B12) участвует в переносе метильных групп и в изомеризации; B9 и B12 тесно связаны.

Большинство коферментов — производные водорастворимых витаминов группы B. Витамин — это «полуфабрикат», из которого в организме собирается кофермент. Поэтому нехватка витамина оборачивается нехваткой кофермента и падением активности зависимых ферментов.

Пиридоксальфосфат (ПФ, из витамина B6, пиридоксина) — кофермент обмена аминокислот. Он переносит аминогруппы (трансаминирование) и участвует в декарбоксилировании и дезаминировании аминокислот.

Тиаминдифосфат (ТДФ, из витамина B1, тиамина) — кофермент окислительного декарбоксилирования α-кетокислот и транскетолазы. Он помогает отщеплять CO₂ и переносить двухуглеродные фрагменты.

Кофермент А (из витамина B5, пантотеновой кислоты) переносит ацильные группы — остатки кислот. Его рабочая часть — тиоловая группа (–SH), к которой присоединяется ацил через богатую энергией тиоэфирную связь (например, ацетил-КоА).

Биотин (витамин H, B7) — кофермент реакций карбоксилирования, то есть присоединения CO₂. Он ковалентно связан с ферментом и служит переносчиком углекислоты.

ФАД и ФМН (из витамина B2, рибофлавина) — переносчики водорода и электронов, как и НАД, но обычно прочно связаны с ферментом (простетическая группа). Флавиновое кольцо принимает 2 атома водорода, превращаясь в ФАДН₂.

Ионы металлов (Zn²⁺, Fe²⁺/³⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Cu²⁺, Se, Co) — распространённые кофакторы. Ферменты с прочно связанным металлом называют металлоферментами. Металл помогает связать субстрат, участвует в катализе (перенос электронов, поляризация связей) и стабилизирует структуру.